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病原微生物样本的采集

2014-05-09 16:57:34 来源: 浏览:

传染病实验室诊断、传染源调查、自然疫源地监测、流行病学调查研究,都以检出特定的病原微生物或其相关物质为目的。这类样本来源主要是人和宿主动物、媒介昆虫,也包括水、土壤、食品等样本供调查传染源。

1、病原微生物样本采集的一般注意事项

1)针对性:不要求样品代表性,强调针对性,尽可能采集病原微生物含量最多的部位。

2)足量:应采用足够检测用的样本,否则可能会得到假阴性结果。

3)多样性:应采集各种可能作为污染源的食物和环境样本,以及各种可能含有病原体的临床样本。

4)及时性:取样后应尽快测定,以利于疾病控制和患者的治疗。

2、样本保存、包装、运送

1)保存:为分离样本中病原细菌或病毒,应根据样本运送时间的长短及不同病原微生物对干燥、温度、营养、pH 值的耐受能力,选择合适的培养基和推荐保存温度。分离培养细菌的样本:在运送培养基中运送并保存于合适的温度,确保目标细菌的存活并抑制其他微生物的过度生长。除脑脊液、尿液和唾液,其他样本若不能在 24小时内处理,多数可存放在室温;若长期保存,除一些低温敏感细节处,应存放在4~8℃条件下。分离病毒的样本:一般应放在保温容器(0~4℃)里,不可放置超过 2 天,尽早送到实验室进行病毒分离。如无条件立即运送或不能立即分离病毒时,应将样本冻存保存。若长期储存,最好置-70℃冻存。检测抗原或抗体的样本:检测抗体的血清可在 4℃条件下保存约 1 周,最长 10 天,超过 1 周必须在-20℃条件下冷冻。注意避免不必要的反复冻融。运送过程中若无设备保证血清的冷冻状态,最好不要冷冻血清。在室温存放血清虽不理想,但仍可用于检测抗体,甚至是存放数周的血清。不要仅因为没有冷冻设备而将已采集的血清轻易弃去。保证样品运送温度的方法:为维持 4~8℃,运送盒中围绕第 2 层容器至少要填充 4个冰袋,可维持冷藏 2~3 天。为保证-20℃条件,在外包装袋内用 2kg 干冰,但需确保二氧化碳能释放以防爆炸,这样可维持样本冷冻 1~2 天,为保证-70℃条件,可采用液氮来储存和运送。

2)包装:根据国际空运和健康相关条例,任何感染性材料的包装和运输都必须遵循 WHO对传染性物质和诊断性样本的安全运送指南(WHO1997)。标准的包装方法和材料应能确保即使在运送中包装意外受损时,也能保护人员安全及样本完整。运送样本时最安全的方式是用由 3 个包装对包装物进行 3 层包装。如要空运,一个完整包装的整个外部尺寸不能小于 250px,每个包装样本中,样本量不超过 4kg 4L(每个原始容器最大 500ml)。每个包装样本中所含的感染物不应超过 50g 50ml。运输样本的外包装必须有明确的标签,标明寄送人和接收人的详细联系方式,包装日期和运输日期等。附带的文件包含样本详细资料(材料种类、性质、数量和日期),相应的生物危害标签及所需的保存温度

3)运送:地面运送样本时,注意将装有样本的箱子紧紧固定在交通工具上,车上还应备有吸水材料、消毒剂、手套、口罩、护目镜、密封防水的废弃物容器等防护用品。为避免路途颠簸引起样本溶血,可在运送前分离血清。在国际、国家和商业有关规定允许下,诊断样本也可空运,但应注意规范包装。分离培养细菌、病毒的样本大多数要求冷藏运送,不耐寒冷的脑膜炎奈瑟菌等应在35~37℃运送。粪便样本因含杂菌较多,常加入甘油缓冲盐水保存液,但甘油缓冲盐水不能用于弯曲菌和弧菌。用于细菌、病毒或寄生虫分离的血液样本需低温保存,不能冷冻,用冰块而不是干冰运送。检测立克次氏体类微生物的全血样本要求干冰保存和冷冻运送。的样品运送要求低温快速。从样本采集到检测的间隔时间要尽可能短,并尽可能将样本处于冷藏状态。检测前保存时间较长时则需冷冻样本以防核酸降解。

3、临床样本采集

1)粪便样本采集:在急性腹泻期及用药前,采集自然排出的新鲜粪便。黏液脓血便挑取黏液或脓血部分 3~5g;液状粪便采取水样便或含絮状物的液状粪便 2~5ml;成型粪便至少取蚕豆大小粪块一块(约 5g)。采集的样本盛于含保存液或增菌液的灭菌容器内送检。若无法获得粪便,可用保存液或增菌液湿润过的棉拭子插入肛门4~125px 深处(小儿 2~75px)轻轻转动一圈,擦取直肠表面黏液后取出,盛入运送培养基或保存液中送检。注意为保证多个检验项目的开展,同一病人应至少采集 2 支肛拭子。

注意事项:勿将尿液或水混入粪便或容器内;任何容器均应用橡皮塞塞紧或螺旋盖旋紧(此处请注意,这与我们平时说的培养时的盖子需透气不一样);容器外面切勿沾染粪便;注意贴好标签;所采取的粪便样本应尽快送检,运送时间不得超过 2 小时,否则应保存在 4~8℃条件下送检;集体腹泻或食源性暴发患者粪便样本采集的数量应根据患者人数决定。

2)咽拭子、洗漱液或痰液样本

a.咽拭子的采集:患者仰头张口,用压舌板压舌,将无菌棉拭子伸入口腔涂抹咽部数次后,放入 2mlHanks 液试管中。注意:将接触手的棉拭子部分及时用无菌镊子折断去掉,管子用橡皮塞盖紧或旋紧。

b.洗漱液的采集:用生理盐水或自配淡盐水 15ml 作为洗漱液。先让病人咳嗽,以洗漱液反复洗漱咽部 1min,直接将洗漱液吐入试管内。

c.痰液的采集

常规痰液:痰液样本的采集以清晨为佳,因晨痰量较多且病原体含量也高。患者晨起后用清水充分漱口数次,以减少口腔正常菌群的污染,然后用力自气管深部咳出痰液,吐至无菌容器内,并尽量防止唾液及鼻咽部分泌物混入,加盖、标识、塑料袋密封、冷藏条件下送检。气管洗涤液:取 8~9 号消毒导管,从鼻腔插入气管内,缓慢注入灭菌蒸馏水 5ml,取出导管,留取患者 3 小时内咳出的痰液,放入无菌容器内加盖,此法宜在清晨空腹时进行。

d.注意事项:采取样本的时间一般在发病第 1 天,最迟不超过 3 天,最好选择体温在 38℃以上时采集。肺部感染应采痰样本,以清晨第 1 口痰为最佳。

3)脑脊液(CSF)样本

一般于出现神经症状时采集,查 IgM 只需一份脑脊液,查 IgG 则需收集 2 次,分别于发病初期和恢复期采集。CSF 样本最好在医院由有经验的医生腰椎穿刺采集,采集量t要求至少 1ml,尽可能采集 3~5ml,采集后分别注入 3~4 支带螺旋帽的无菌试管中,1ml/管,原则上第 1 管用于细菌学检测(作厌氧培养时,样本应注入厌氧瓶内),第 2 管送疾病预防控制中心专业实验室复核或做其他微生物检测,第 34 管分别用于临床生化及常规检测。用于细菌培养的样本应立即送检,运送大多不需要运送培养基且不能冷冻。因脑膜炎奈瑟菌离体后迅速自溶,容易死亡,最好作床边接种。用于病毒培养时也无须运送培养基,样本在 4~8℃条件下最多可维持 48 小时,更长时间需在-78℃保存。

4)血液样本

a.物品准备:备齐碘伏、压脉带、无菌棉签、棉球、真空采血针与持针器(或注射器)等,根据检验项目备齐各种采血管。

b.采样步骤及注意事项

确定静脉:正中静脉粗大浅表,对受检者造成的痛苦最小,是最常选用的静脉采血部位,也可选用其他部位的静脉;用食指或中指触摸感觉静脉位置决定穿刺点。

消毒穿刺点:用碘伏拭子以静脉穿刺点为中心向外环状擦拭,范围直径至少 250px,风干过程防止接触此处皮肤,否则需要重新消毒;若采集培养样本,还需消毒采血管和培养瓶穿刺部位。

穿刺操作:让受检者上身与地面垂直,肘部置稳固台面或床面枕垫上,使上臂与前臂呈直线,手掌略低于肘部,充分暴露静脉穿刺点;拧松并轻轻除掉针头上的硬质封套,一只手握住胳膊并绷紧皮肤,另一只手拇指和食指持带针持针器或注射器与上臂成 15 度角,迅速穿刺进针,感觉针头前端阻力突然消失并有突破落空感时停止。

观察回血:进针后一只手固定持针器,另一只手将真空采血管标签向下置入持针器中并推至顶端,使双向针后端针头穿透采血管胶塞,并立即观察回血;若未见回血,则将其视为带负压注射器,在皮下移动寻找静脉;一旦针头进入静脉,即可见回血,此时应嘱受者松拳并松开压脉带,使采血管底部低于采血针前端。

采集足量样本:单手继续固定持针器,管内真空缓慢柔和地将血样本吸入采血管直至真空耗尽,血流停止。

更换采血器:待血管内血流完全停止后,单手严格固定持针器,另一只手拔出采血管并立即轻轻颠倒混匀 5~8 次;若需采集多管血样本,可再向持针器内插入另一支采血管,然后重复相应步骤。

c.血液样本采集与处理:作血液病原培养时,严格用无菌穿刺法采静脉血,成人采血10~15ml,儿童 2~5ml,婴儿 0.5~2ml。所采血液移入无菌有螺口、加入抗凝剂的容器或培养瓶中送检。作病原培养的血液样本在环境温度下大多可存放 24 小时,如时间更长则需在 4~8℃下保存或运送。作抗体检测时,用于检测 IgM 的血清一般采于发病 1 个月内;用于检测 IgG 的血清应收集 2 次,第 1 次于发病初期(1~3 天),越早越好,第 2 次一般在恢复期(第 1 次采血后 3~4 周)。检测双份血清抗体滴度,有 4 倍以上升高时有诊断意义。用于微量法检查抗体的样本,可用三棱针刺手指或耳垂部,再用毛细管采集,一般不少于0.3ml。采集血清样本可将 10ml 静脉血移入无抗凝剂的无菌螺口管,室温静置 30min 使之凝集,然后置冰盒中 4~8℃条件下至少 1~2 小时(在此温度下可保存 48~72 小时)。血清样本可在实验室低速离心(1000×g10min)以弃残存血细胞。如能立即检测,采集的血液应在室温下 24 小时内尽快分离血清;如果 24 小时内不能送达实验室,应在运送前尽可能分离血清。血清在 4~8℃条件下最多保存 10 天。如果长期不检测,应冷冻血清。若现场不能分离血清,血样本应在 4~8℃条件下保存,未分离的血样本不能冷冻保存。作血片、暗视野检查可采耳垂血或指血。当怀疑为真菌感染时,应采集双份量,分别作双相培养。

5)尿液样本:一般应采集晨起第一次尿液送检;原则上应在使用抗菌药前采样。一般采集中段尿,体检和门诊患者多自取。住院病人需作病原检查时,成年女性以肥皂水洗外阴,再以灭菌水或 0.1%高锰酸钾溶液冲洗尿道口,然后排去前段尿 10ml 左右于无菌容器内,立即送检;男性先用肥皂水清洗尿道口,用清水冲洗后,采集中段尿送检。对昏迷或尿潴留患者可通过导尿术留取样本;当怀疑菌尿来自肾盂时,可用导尿管采集左右两侧肾盂尿(此法一般请泌尿科医生协助采集),左右侧样本应标记明确,避免错误。用导尿管采尿一般为 10~15ml,若为长期留置尿管者,应更换新尿管留取样本。样本最好在 2~3 小时内送到实验室检测,否则也不要冷冻,可在 4~8℃条件下保存运送样品,低温可抑制污染菌的过度生长,维持病毒的稳定。

6)皮肤样本

大多数皮肤病的诊断主要依据体格检查和临床病史,不需要采集样本。在诊断不明确、表现异常等少数情况下,需要采集皮疹或皮肤病变样本。出现囊疱疹或脓疱疹时,可直接从囊泡或脓泡采集液体用于镜检,或选择典型或透明清亮的新鲜疱疹,用无菌生理盐水棉签清洁表面两次并蘸干皮肤后,用无菌针尖刺破皮肤疱疹,用无菌棉签挤出并蘸取疱疹液立即置于盛有细胞维持液的塑料离心管中,旋紧螺盖,用于培养。再次用生理盐水或消毒酒精擦拭进针部位,无菌干棉签按压少顷,防止感染。怀疑皮肤炭疽或淋巴腺鼠疫时可从病变皮肤(焦痂和腹股沟淋巴结)取样做细菌学培养。

7)其他临床样本

a.生殖器器官样本

外阴部样本:采用无菌棉拭子直接擦拭男性或女性外阴部溃疡面采分泌物,放入采样液中,旋紧盖子,标记后塑料袋密封,立即低温运送至实验室。阴道、尿道、前列腺和子宫分泌样本 女性患者用肥皂及 0.1%高锰酸钾溶液冲洗外阴和尿道口;男性患者用 2%红汞或 0.1%苯扎溴铵消毒尿道口后,用无菌纱布或无菌干棉球拭干,再以无菌操作方式采取腔道内病变部位样本。

b.穿刺液样本 包括胆汁、胸水、腹水、心包液、关节液和鞘膜液等,原则上需请临

床医师在使用药物前以无菌穿刺术抽取;胸水和腹水抽取量均为 5~10ml,心包液和关节液等为 1~5ml;样本抽取后立即以无菌操作法注入含抗凝剂的无菌试管中,充分混合后立即送检。

c.角膜拭子样本 用湿润的无菌棉签在眼角膜下部轻轻擦拭 2~3 次,采集分泌物,置保存液中混匀,标识后冷藏送检,或低温保存。

4、动物宿主样本采集

1)家畜样本采集:参照临床样本和解剖样本采集

2)野生大动物和鸟类样本采集:按检验需要抽心血、取脏器和采集体处寄生虫,分别送检。

3)啮齿类动物样本采集:鼠间鼠疫流行的疫源地按鼠疫耶尔森菌的方法采集。疫源监控按鼠密度调查方法捕捉。在寄居洞口和鼠行路或人行小路两侧,间隔 2~5m 放笼,傍晚放,清早收,捕获笼用布袋套装送检验室,检菌前鉴定鼠种,寄生蚤并作记录。

4)昆虫及节肢动物样本采集:应采集活样本,并保持肢体完整,以利动物种类的鉴定。运送的容器要透气并保持所需的温湿度和避免挤压。采集的数量:蚤≥50 只,蜱≥20只,昆虫 20~50 只。采集方法参见相应经虫媒传播微生物的样本采集。




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